12. Versuch: Kristallisation von Proteinen mittels Gasphasendiffusion

Die Bestimmung der Proteinstruktur mit atomarer Auflösung erfolgt sehr oft mittels Röntgenbeugung an Proteinkristallen. In diesem Versuch lernen Sie eine gängige Methode der Proteinkristallisation kennen: die Gasphasendiffusion am hängenden Tropfen. Als Ergebnis sollen tetragonale Kristalle von Hühnereiweißlysozym erhalten werden (Abb.).

Betreuer

Versuchsanleitung (PDF)

Fragen zur Versuchsvorbereitung

• Was ist Lysozym? Woraus wird es isoliert? Was ist seine Funktion? Welche Reaktion katalysiert es? Was ist seine Molekülmasse und sein isoelektrischer Punkt?
• Wie hoch ist die molare Konzentration von Natriumchlorid in einer 5%igen (w/v) Lösung?
• Wie hoch sind vor bzw. nach der Äquilibrierung der Tropfen die Konzentrationen von a) Protein, b) Puffer, c) Präzipitant? (Siehe dazu die Versuchsanleitung, Abschnitt 5)
• Im Tropfen eines Kristallansatzes (Volumen 2 µl) mit einer Lysozymkonzentration von 25 mg/ml wächst ein Kristall, der vereinfacht als Kubus mit 0,3 mm Kantenlänge angenommen wird. Der Anteil des Lösungsmittels im Kristall betrage 40%. Welcher Anteil der für den Tropfen eingesetzten Proteinmenge befindet sich in diesem Kristall?
• Für den Versuch setzen Sie und Ihr Praktikumspartner jeweils eine Kristallplatte mit 24 Tropfen an. Pro Tropfen benötigen Sie 1 µl Protein der unten genannten Konzentrationen. Wieviel Protein müssen Sie zu Beginn des Experiments in Puffer auflösen, um genug Lösung für alle Tropfen in den beiden Platten zu haben?