11. Versuch: Größenbestimmung von DNA-Fragmenten und Proteinen mit Gel-Elektrophorese

Seien Sie für diesen Versuch bitte pünktlich um 09:00 s.t. im Labor!

Wegen der guten Trenneigenschaften und der vergleichsweise einfachen Durchführung gehören elektrophoretische Verfahren zum Standardrepertoire in einem biochemischen und biophysikalischen Labor. Sie dienen der Bestimmung von Molekulargewichten, der Reinheitskontrolle von präparierten Proteinen, der DNA-Analyse bei molekularbiologischen Arbeiten, der DNA-Sequenzierung z.B. bei Genomprojekten oder, gekoppelt mit massenspektrometrischen Verfahren, zur Identifikation aller Proteine in einer Zelle ("Proteomics"). Im Praktikumsversuch sollen Sie durch zwei elektrophoretische Verfahren die Größen verschiedener Makromoleküle bestimmen: zum einen die der häufigsten Proteine in Hühnereiweiß, Milch und Blut, und zum anderen die Größe der DNA-Fragmente, die beim Verdau der DNA des Bakteriophagen Lambda mit zwei Restriktionsendonukleasen entstehen.

Betreuer

Versuchsanleitung (PDF)

Fragen zur Versuchsvorbereitung

Berechnen Sie aus den gegebenen Schnittstellen für die beiden Restriktionsenzyme EcoRI und HindIII in der Lambda-DNA, wie groß die entstehenden DNA-Fragmente sind, und zwar bei einem Verdau a) nur mit EcoRI, b) nur mit HindIII und c) bei gleichzeitiger Anwendung beider Enzyme!
Wieviele EcoRI-Schnittstellen erwarten Sie durchschnittlich in einer zufälligen DNA-Sequenz von 48502 Basenpaaren Länge?
Wo könnten Sie SDS im Haushalt finden?
Wie sieht die Struktur von Mercaptoethanol und Dithioerythritol aus? Warum können diese Substanzen Disulfidbrücken in Proteinen aufbrechen?
Welche Protonierungsgleichgewichte können am Glycin vorliegen?
Welche Funktion hat das Serumalbumin im Blut?
Bonusfrage: Woran können Sie erkennen, dass der Probenpuffer für die SDS-PAGE SDS, Mercaptoethanol und Bromphenolblau enthält?